失望之余，他逐渐认清了朝廷的真实面目，激发起反抗朝廷和地方官府压迫的想法。回到云南之后，便在云州（今云县）、蒙化等地暗中组织回民，酝酿大规模武装起义。
1856年8月，杜文秀乘云南提督文祥率兵离大理赴楚雄的有利时机，在蒙化率众发起武装起义。
9月7日杜万荣、蓝金喜在大理府城揭杆起义，杜文秀闻讯，立即率手下回民为主的起义军前往大理，与当地回民会合大败清军，毙迤西道林廷禧、太和（今大理）知县毛玉成等。9月16日大理知府唐惇培败逃宾川（今宾川南），回民起义军胜利占领大理城。
夺据大理的胜利，使一部分起义军首领昏昏然，他们不去组织力量防御清军的进攻，却自恃有功争权夺利。有的起义军首领抱有传统的民族偏见，任令部众抢掠汉人，引起大理群众十分不满。
这时，杜文秀挺身而出，组织指挥部众击退了鹤丽镇千总张正泰对大理的进攻，并且明确提出：“欲做大事，必须收拾人心，不宜专尚威力。且汉众回寡，尤须重用汉人。”
杜文秀在正确是时候提出了正确的主张，得到起义军上下的赞同。由于他“精力强壮，忠直廉洁，素为众人所敬仰”，遂被推举为总统兵马大元帅。
10月23日，滇西回民起义军齐集大理校军场筑坛拜帅。杜文秀以原提督署为大元帅府，组织大理武装起义政权。授蔡法春为扬威大都督，总各路军事，其他文武官员也各有职称。宣布“遥奉太平天国南京之召号，反对满清统治”，并通令“改正朔，蓄全发，易衣冠”，以示推翻满请朝廷的决心。
为了巩固新生政权，杜文秀领导下的大理政权制定各种法律法令，实行了一系列有利于发展反清事业的方针政策。
第一，对各族百姓一视同仁，平等对待，改善民族关系。还在起义之初，杜文秀就提出了“重用汉人”的正确主张，大理政权建立以后，即实行“不分汉回，一体保护”的方针，对其他民族百姓，也采取同样的政策。
杜文秀制定的《管理军政条例》规定：“族分三教，各有根本，各行其是。既同营干事，均宜一视同仁，不准互相凌虐。”
这种“无分汉回夷，一以公平处之”的民族政策，改善了大理政权控制地区各民族之间的关系，得到了他们的拥护和欢迎。
第二，减轻百姓负担，努力发展生产。大理政权规定废除丁银（人口税）和其它苛捐杂税，田赋只征粮米；“地方税课，旧有例者，方准抽收。不得私加名目，妄自征收”，以减轻百姓负担。
同时，大力发展生产。农业方面，发放耕牛、农具，招民垦荒，奖励农耕。对工商业，采取保护和促进的政策，严禁文武官员“以官压市，轻价估买”，积极发展纺织、采矿、制盐等工业生产。
随着生产的发展，不但百姓生活有了一定程度的改善，而且使起义军有充足的军饷，保证了反清斗争的继续进行。
第三，制定军事制度，严格组织纪律。起义初期凡属回民青壮年都要当兵。大理政权建立后，规定回族三丁抽一，五丁抽二；对汉族和其他民族，则分派一定的数额，由其各自出兵。
一切军机事宜，须集体商酌，最后由元帅裁决。遇有大的军事行动，派出统带官作为元帅代表统率部队，带兵官不论何职，都要服从统带官的指挥。起义军中有严格的军纪和赏罚制度，鼓励将士服从命令，英勇作战。
杜文秀还特别强调群众纪律，规定起义军不得“无故下乡，滋扰良民”，或“故意纵放牲畜，践踏田禾”，严禁“毁拆庙宇，扰害民房”，不准“强买估卖”等等。以上规定和军纪，保证了起义军的兵源，统一了帅府的军事指挥，取得了当地百姓的信任和支持，提高了起义军的战斗力。
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